Ariotake - Revista de Investigación Veterinaria y Amazonía
Vol. 1 Núm. 2: e186 (2022)
https://doi.org/10.55873/ariva.v1i2.186
e-ISSN: 2810-8787
Universidad Nacional Amazónica de Madre de Dios
Artículo original / Original article
Cómo citar / Citation: Pérez-Durand, M. G., Luque-Mamani, N., Quispe-Quispe, A. E., Condori-Chuchi, E. A.,
Rodríguez-Huanca, F. H., Manrique-Quispe, Y. P. & Perez-Guerra, U. H. (2022). Evaluación de la sobrevivencia y
fertilidad in vivo de espermatozoides del epidídimo de toros criollos post mortem. Ariotake - Revista de Investigación
Veterinaria y Amazonía, 1(2), e186. https://doi.org/10.55873/ariva.v1i2.186
Evaluación de la sobrevivencia y fertilidad in vivo de espermatozoides
del epidídimo de toros criollos post mortem
Evaluation of survival and in vivo fertility epididymal sperm of Creole
Bulls post mortem
Manuel Guido Pérez-Durand 1 ; Natalio Luque-Mamani 1 ; Abel Eleazar Quispe-
Quispe 1 ; Eloy Amador Condori-Chuchi 1 ; Francisco Halley Rodríguez-Huanca 1
; Yan Pierr Manrique-Quispe 2* ; Uri Harold Perez-Guerra 1
1Universidad Nacional del Altiplano, Puno, Perú
2Universidad Nacional Amazónica de Madre de
Dios, Puerto Maldonado, Perú
Recibido: 10/04/2022
Aceptado: 29/06/2022
Publicado: 25/07/2022
*Autor de correspondencia: ymanrique@unamad.edu.pe
Resumen: El objetivo del presente estudio fue determinar la sobrevivencia in vitro y la fertilidad
in vivo de espermatozoides recuperados de la cola del epidídimo de toros criollos post mortem. Se
colectaron 18 pares de testículos de toros criollos adultos del camal municipal El Collao-Ilave,
posterior a su sacrificio. Cada par de testículos fueron transportados al laboratorio y almacenados
aleatoriamente en refrigeración a 5°C durante 0 (n=6), 12(n=6) y 24(n=6) h. Al final de cada
periodo, los espermatozoides fueron colectados y evaluados antes de la congelación y después
de la descongelación en motilidad total, motilidad progresiva, test hiposmótico e integridad de
acrosoma, congelados con dilutor Tris-yema de huevo (10%)-glicerol (7%) en pajillas de 0,25 mL
con 30x106 espermatozoides motiles/pajilla. La prueba de fertilidad in vivo se realizó en 13 vacas,
evidenciando que las características espermáticas evaluadas se preservaron antes de la
congelación, pero a la descongelación fueron afectados por efecto de la refrigeración. Producto
del proceso de la congelación y los espermatozoides congelados-descongelados, tuvieron
capacidad de fertilizar. Por tanto, los espermatozoides colectados son congelables y pueden
aplicarse en técnicas reproductivas asistidas.
Palabras clave: espermatozoide; epidídimo; fertilidad; inseminación artificial
Abstract: The objective of this study was to determine the in vitro survival and in vivo fertility of
spermatozoa recovered from the tail of the epididymis of Creole bulls post mortem. Eighteen
pairs of testicles from adult Creole bulls from the El Collao-Ilave Municipal slaughterhouse were
collected after their sacrifice. Each pair of testes were transported to the laboratory and randomly
stored refrigerated at 5°C for 0(n=6), 12(n=6) and 24(n=6) h. At the end of each period,
spermatozoa were collected and evaluated before freezing and after thawing for total motility,
progressive motility, hyposmotic test, and acrosome integrity, frozen with Tris-yolk (10%)-
glycerol diluter ( 7%) in 0.25 mL straws with 30x106 motile spermatozoa/straw. The in vivo
fertility test was performed on 13 cows, evidencing that the evaluated sperm characteristics were
preserved before freezing, but upon thawing they were affected by the effect of refrigeration.
Product of the freezing process and the frozen-thawed spermatozoa had the capacity to fertilize.
Therefore, the collected spermatozoa can be frozen and can be applied in assisted reproductive
techniques
Keywords: spermatozoon; epididymis; fertility; artificial insemination
Evaluación de la sobrevivencia y fertilidad in vivo de espermatozoides del epidídimo de toros criollos … 2
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1. Introducción
La cola del epidídimo es uno de los principales lugares de almacenamiento de espermatozoides
antes de la eyaculación, cuyo ambiente provee una condición ideal para la supervivencia
espermática. Así, espermatozoides almacenados dentro de esta estructura retienen su motilidad
y su capacidad fertilizante (White, 1933; Soler et al., 2005; Martins et al., 2009). La cola del
epidídimo es capaz de almacenar un número suficiente de espermatozoides para varias
eyaculaciones, lo que determina que este lugar sea una fuente de germoplasma aún poco
explorada comercialmente en el toro (Ribeiro-Peres et al., 2014).
Generalmente se asume que los gametos dentro del cuerpo de los animales degeneran
rápidamente después de la muerte (Soler et al., 2005), pero muchos estudios han demostrado que
los espermatozoides recuperados de especies post mortem, incluso muchas horas después de la
muerte, retienen sus funciones (Songsasen et al., 1998; An et al., 1999; Kishikawa et al., 1999; Yu
& Leibo, 2002). Sin embargo, la viabilidad de los espermatozoides puede ser afectada por la
duración y la temperatura al cual el animal muerto o los testículos son sometidos antes de que
los espermatozoides sean colectados de la cola del epidídimo. Además, bajo una variedad de
condiciones no siempre es posible la inmediata colección y congelamiento de espermatozoides
del epidídimo, debido a la falta de técnicos y/o equipos (Kaabi et al., 2003; Soler et al., 2005).
En bovinos, existen pocos estudios sobre la colecta, criopreservación y uso en técnicas
reproductivas asistidas utilizando espermatozoides de la cola del epidídimo, teniendo en cuenta
que, en algunas situaciones, esta puede ser la última oportunidad para la preservación de los
gametos de un toro. Se realizó esta investigación con la finalidad de recuperar y congelar
espermatozoides de la cola del epidídimo de toros post mortem, con su consiguiente aplicación en
técnicas reproductivas asistidas. Por consiguiente, el objetivo del presente trabajo de
investigación fue determinar la sobrevivencia in vitro y la fertilidad in vivo de espermatozoides
recuperados de la cola del epidídimo de toros post mortem.
2. Materiales y métodos
El presente trabajo de investigación se realizó en el Laboratorio de Reproducción Animal de la
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, que se encuentra ubicado a una altitud de 3820
msnm. Se colectaron 18 pares de testículos de toros criollos adultos del camal Municipal de la
Provincia del Collao-Ilave, durante los meses de agosto a diciembre del 2013. Una vez
transportado al laboratorio cada par de testículos fueron almacenados en refrigeración a 5°C de
forma aleatorio durante 0 h (n=6), 12 h (n=6) y 24 h (n=6) respectivamente.
2.1. Colección y Transporte de los Testículos
Los testículos se colectaron con su escroto respectivo, de toros criollos adultos, inmediatamente
después del sacrificio. Los complejos escroto-testículos-epidídimos fueron identificados y
colocados dentro de una caja de tecnopor para su transporte hacia el laboratorio. El transporte
duró aproximadamente entre 2 h a 4 h.
2.2. Colección de Espermatozoides del Epidídimo
Al final de cada periodo de refrigeración se realizó la colección de los espermatozoides de la cola
del epidídimo mediante el método descrito por Martins et al. (2009), con ciertas modificaciones;
En primer lugar, se procedió a diseccionar y separar la región de la cola del epidídimo de la región
del cuerpo del epidídimo y del conducto deferente. Una vez separada la cola del epidídimo se
realizó la fijación del mismo por su borde de inserción con la ayuda de una pinza hemostática
tipo mosquito. Luego se realizó 2 a 3 incisiones en el borde libre de la cola del epidídimo con la
ayuda de un bisturí con hoja Nº 22 y raspando suavemente en las superficies de los cortes
realizados se dejan caer 2 a 3 gotas de contenido epididimal en un tubo de ensayo de 15 ml que
contenía 2 ml de dilutor Tris-yema de huevo precalentado a 35°C.
Pérez-Durand, M. G. et al. 3
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2.3. Evaluación de Espermatozoides Epididimarios
Las muestras de espermatozoides fueron evaluadas en concentración, vitalidad, morfología,
motilidad total, motilidad progresiva, test hiposmótico (HOST) e integridad de acrosoma. La
evaluación de la concentración se realizó mediante el método de Hemocitómetro. La vitalidad y
morfología espermática se realizó mediante el uso de la tinción de Eosina-Nigrosina. La
evaluación de la motilidad total y motilidad progresiva se realizaron a 37°C con un aumento de
200 a 400X. La evaluación de HOST se realizó por el método descrito por Jeyendran et al. (1984)
con ciertas modificaciones a un aumento de 400X. La evaluación de la integridad de acrosoma se
realizó mediante el método descrito por Awad & Graham (2004), con ciertas modificaciones a un
aumento de 1000X siendo de la misma forma durante la descongelación de semen. Todas las
evaluaciones microscópicas fueron realizadas en un microscopio de contraste de fases LEICA
DM750.
2.4. Congelación de Espermatozoides Epididimarios de Toros Criollos post mortem
Las muestras espermáticas fueron diluidas con Tris – yema de huevo (10%) – glicerol (7%) y fue
enfriada en forma gradual y lentamente de 35°C hasta 5°C por un periodo de 5 h. Las muestras
de espermatozoides fueron envasadas en pajillas de 0,25 ml con una concentración total de 30x106
espermatozoides y equilibradas por 1 h. La congelación fue realizada en vapores de nitrógeno
líquido (NL) a 4 cm sobre el nivel de NL por 10 min, finalmente fueron sumergidas directamente
en el NL a -196ºC y almacenadas en el termo criogénico hasta su evaluación y/o uso en
inseminación artificial. La descongelación se realizó en Baño María a una temperatura de 37ºC
por un periodo de 45 s.
2.5. Prueba de Fertilidad in vivo de espermatozoides del epidídimo de toros post
mortem
Para determinar la prueba de fertilidad in vivo se realizó mediante la inseminación artificial de 13
vacas Brown Swiss del Centro de Investigación y Producción (CIP) de Chuquibambilla durante
los meses de junio a agosto del 2014, con muestras espermáticas obtenidas del epidídimo de un
toro criollo post mortem que correspondía al periodo de refrigeración de hora 0 (0 h), con una
concentración de 50 x 106 espermatozoides/pajilla. La fertilidad “in vivo” de espermatozoides del
epidídimo post descongelados se determinó mediante evaluación ecográfica entre los días 30 –
35 post inseminación.
2.6. Análisis Estadístico
Para determinar el efecto de los diferentes periodos de refrigeración (0, 12 y 24 h) de los
epidídimos a 5ºC sobre la motilidad total, motilidad progresiva, test hiposmótico e integridad de
acrosoma antes de la congelación y después de la descongelación fueron evaluados mediante el
Análisis de Variancia (ANVA) bajo un Diseño Completamente Aleatorio, con un nivel de
significancia de α = 0,05. Las medias de los tratamientos fueron comparadas con el uso de la
Prueba de Tukey. Se usó el software estadístico de S.A.S. (Versión 9.2). Para determinar el efecto
del proceso de la congelación-descongelación sobre la Motilidad Total, Motilidad Individual, Test
Hiposmótico e Integridad de Acrosoma fueron evaluados mediante el estadístico de Ji-cuadrada,
con un nivel de significancia de α = 0,05.
3. Resultados
3.1. Motilidad Total y Progresiva
Los resultados en motilidad total y progresiva se muestran en la Tabla 01, donde a la evaluación
antes de la congelación no fue afectada por efecto de la refrigeración de los epidídimos a 5ºC por
0, 12 y 24 h (p>0,05), pero a la descongelación si fue afectada tanto por el efecto de la refrigeración
(p≤0,05) y como por el efecto de la congelación-descongelación (p≤0,05).
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3.2. Test hiposmótico (HOST)
Los resultados en test hiposmótico se muestran en la Tabla 01, donde a la evaluación antes de la
congelación no fue afectada por efecto de la refrigeración de los epidídimos a 5ºC por 0, 12 y 24 h
(p>0,05) pero a la descongelación si fue afectada por el efecto de la refrigeración de los epidídimos
(p≤0,05). En cambio, el proceso de la congelación - descongelación no afectó en el periodo de
refrigeración a 0 h (p>0,05); sin embargo, si afectó en los periodos de refrigeración a 12 y 24 h
(p≤0,05).
3.3. Integridad de Acrosoma
Los resultados en integridad de acrosoma se muestran en la Tabla 01, donde a la evaluación antes
de la congelación no fue afectada por efecto de la refrigeración de los epidídimos a 5ºC por 0, 12
y 24 h (p>0,05) pero a la descongelación sí fue afectada por el efecto de la refrigeración de los
epidídimos (p≤0,05). En cambio, el proceso de la congelación - descongelación no afectó en el
periodo de refrigeración a 0h (p>0,05); sin embargo, sí afectó en los periodos de refrigeración a
12 y 24 h (p≤0,05).
3.4. Prueba de fertilidad in vivo de espermatozoides de toros criollos post mortem
Mediante el diagnóstico ecográfico entre los días 30 – 35 post inseminación, se encontró una
fertilidad del 69,2% (9/13).
Tabla 1. Características espermáticas de espermatozoides de la cola del epidídimo de toros
criollos post mortem.
Tiempo de refrigeración a 5°C
0h
(n=6)
12h
(n=6)
24h
(n=6)
Antes de la congelación
Motilidad Total (%)
80,06 ± 11,68
74,43 ± 10,78
70,25 ± 14,47
Motilidad Progresiva (%)
44,76 ± 10,31
37,41 ± 12,20
30,97 ± 9,75
Test Hiposmótico (%)
69,72 ± 7,20
67,87 ± 4,46
60,31 ± 7,91
Acrosoma Intacto (%)
62,18 ± 7,66
64,83 ± 3,69
59,51 ± 7,13
Después de la descongelación
Motilidad Total (%)
49,26 ± 15,68a
26,41 ± 6,82b
24,92 ± 4,89b
Motilidad Progresiva (%)
19,57 ± 5,18a
12,55 ± 4,25b
11,19 ± 2,72b
Test Hiposmótico (%)
53,21 ± 5,53a
31,99 ± 6,87b
27,47 ± 4,86b
Acrosoma Intacto (%)
48,33 ± 4,45a
28,90 ± 7,25b
23,87 ± 6,95b
Nota: Letras superpuestas diferentes indican diferencias (p≤0,05) entre periodos de refrigeración.
4. Discusión
En general, se encontró una preservación de la motilidad total, motilidad progresiva, HOST e
integridad de acrosoma durante la refrigeración de los epidídimos a 5°C durante 24 h. Lo cual
confirma lo encontrado por Martins et al. (2009) en toros; por Kaabi et al. (2003) en ovinos y por
Soler et al. (2005) en ciervos. Esto evidenciaría que el epidídimo posee condiciones adecuadas
para prolongar la supervivencia del espermatozoide (Martins et al., 2009). Además, la viabilidad
espermática es afectada por la duración y temperatura al cual es sometido el animal muerto o los
testículos antes de que los espermatozoides sean colectados de la cola del epidídimo (Soler et al.,
2005). Por consiguiente, la refrigeración a 5°C es necesaria para minimizar la pérdida de energía,
el compromiso de la integridad espermática y extender la supervivencia espermática, así como la
capacidad fertilizante por extensos períodos (Soler et al., 2005; Martins et al., 2009).
En cambio, a la descongelación se encontró que las características espermáticas evaluadas fueron
afectadas drásticamente por el proceso de la congelación-descongelación y conforme aumentaba
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el periodo de refrigeración, aunque a la descongelación en el periodo de refrigeración a 0 h se
encontró tasas espermáticas aceptables en el HOST. Sin embargo, en los espermatozoides de
epidídimos refrigerados a 5ºC por 12 y 24 h se encontraron menores tasa de recuperación en todas
las características evaluadas a la descongelación, esto debido posiblemente a que los
espermatozoides refrigerados sufren más daños por efecto de la congelación y descongelación
(Martins et al., 2009). En contraste con los resultados del presente trabajo, se ha reportado que
una alta proporción de espermatozoides pierden su motilidad u otras funciones después de la
descongelación debido al daño durante el proceso de la congelación-descongelación y la
recuperación de la motilidad espermática es menor que 50% en la mayoría de los mamíferos. Con
respecto a las causas que produce el daño espermático por el proceso de la congelación-
descongelación existen varias hipótesis como shock por frío, estrés osmótico, formación de
cristales de hielo y por daño oxidativo (Watson, 2000).
El resultado obtenido en fertilidad in vivo (69,2%), con la consiguiente obtención de 4 crías sanas,
muestra uno de los primeros reportes de fertilidad mediante la inseminación artificial con
espermatozoides congelados (-196ºC) obtenidos de la cola del epidídimo de un toro muerto. Este
resultado es mayor a lo reportado por Costa et al. (2011) quienes encontraron una tasa de
gestación del 20% con el nacimiento de 2 crías. Resultados similares fueron publicados en otros
rumiantes, así como en ovinos por Ehling et al. (2006) encontraron una tasa de parición del 87,5%
inseminadas con semen de epidídimo congelado-descongelado.
Por otro lado, en ciervos por Soler et al. (2005), realizaron la inseminación intrauterina de 66
hembras usando muestras espermáticas epididimarios de 3 machos encontrando una fertilidad
total del 56,0%. Así mismo, en esta misma especie Garde et al. (1998) encontraron 23,5% de crías
logradas (4/17). Estos resultados muestran que este método de conservación de semen es
eficiente y asociado con altas tasas de fertilidad.
Figura 1. Terneras nacidas procedentes del semen de epidídimo de toros post mortem
5. Conclusiones
La refrigeración de los epidídimos a 5ºC preservó por 24 h todas las características espermáticas
evaluadas antes de la congelación; sin embargo, a la descongelación fue afectada tanto por el
proceso de la congelación-descongelación, así como por el efecto de la refrigeración de los
epidídimos. Encontrándose mejores resultados en el periodo de refrigeración de 0 h. Los
espermatozoides congelados-descongelados obtenidos del epidídimo de toros post mortem tienen
la capacidad de fertilización y obtener descendencia satisfactoriamente.
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Financiamiento
Ninguno.
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Contribución de autores
Q-Q, A. E.: Preparación y ejecución.
P-G, U. H.: Preparación, ejecución y supervisión del estudio.
P-D, M. G.: Desarrollo de la metodología, supervisión, concepción y diseño del estudio.
R-H, F. H.: Desarrollo de la metodología y edición del artículo.
L-M, N.: Concepción y diseño.
C-C, E. A. y M-Q, Y. P.: Edición del artículo.
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